多模态自适应光学显微镜：从分子到生物体的活体成像

# 用于从分子到生物体活体成像的多模态自适应光学显微镜 来源：https://www.nature.com/articles/s41592-026-03066-1?error=cookies_not_supported&code=9cd34cfc-bba2-411c-8ca9-28d540dfee86 ## 引言 自科学家首次通过透镜观察细胞以来，光学显微镜塑造了我们对生命运作方式的理解，揭示了从单分子动力学到整体生物发育的过程，研究对象涵盖培养细胞系、类器官、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等多种模式系统。历史上，这种多样性推动了不同显微镜模态的发展，包括宽场、共聚焦、光片和双光子显微镜，每种模态都针对特定需求进行了优化¹、²。这些模态的超分辨率变体³、⁴进一步扩展了光学显微镜的范围和功能。 然而，为某一模态或某一类样品进行优化必然会带来限制，从而影响对其他系统的研究。这些限制不仅包括视场和分辨率等光学特性，还包括样品安装和环境控制等实际考虑因素。例如，高数值孔径物镜优化了空间分辨率，但牺牲了视场和工作距离。光片显微镜能够实现低光毒性体积成像，但可能需要非传统的安装方式或倒置系统中复杂的接力光学系统⁵。双光子点扫描增加了成像深度，但往往牺牲了速度和宽多色能力⁶、⁷。因此，现代成像核心或设备完善的显微镜实验室通常需要支持多台适用于不同任务的仪器，从而增加了成本和操作复杂性。此外，几乎所有构成成像核心基础的商用显微镜都忽视了"房间里的大象"：样品引起的光学像差，这些像差会迅速损害在多细胞应用中的性能。 为了解决这些问题，我们开发了具有自适应成像校正的多模态光学显微镜（MOSAIC），这是一种单一显微镜，可按需重新配置为不同的成像模态，每种模态针对不同类别的样本进行了优化。我们在广泛的生物系统和时空尺度上展示了MOSAIC的能力，包括活贴壁细胞中的单分子追踪、分离细胞和发育生物体中的细胞器重塑、活体小鼠皮层中单棘分辨率下的神经活动量化，以及跨越毫米级透明组织中神经元超微结构的映射。综合来看，这些应用突出了MOSAIC在以下模态间无缝切换的能力：用于无标记对比的斜透射光照明、宽场荧光成像、三维结构光照明显微镜、晶格光片显微镜、晶格光片-SIM、图像扫描显微镜以及用于活体成像的双光子点扫描显微镜。值得注意的是，所有模式都可以应用自适应光学直接波前传感⁸校正来对抗样品引起的像差，确保在深度处获得最佳性能。通过在不同模式间复用相同的硬件和软件，MOSAIC相对于购买多台独立仪器降低了总体成本并最小化了空间占用。它还使得在同一生物样品上进行不同成像方法的定量比较成为可能，并为需要动态切换模态的自适应成像协议开辟了道路。 ## 结果 ### 显微镜设计与表征 MOSAIC被构思为LLSM设计的演进版本，加入了双通道AO校正（AO-LLSM）⁹。原始仪器使用0.65-NA激发物镜和1.1-NA检测物镜，以及一个0.8-NA的倒置荧光物镜从下方观察样品¹⁰。虽然这种布置优化了3D空间分辨率，但它也对工作距离和样品几何形状施加了严格限制，通常将样品限制在位于物镜之间的5毫米直径盖玻片上。对于MOSAIC，我们选择了0.6-NA激发物镜、1.0-NA检测物镜和一个经过盖玻片校正的1.0-NA倒置荧光物镜（补充图1a）。虽然这带来了分辨率的适度降低¹¹，但这些选择将光片物镜与盖玻片之间的有效工作距离从接近零增加到330微米（补充图1a），从而可以容纳25毫米直径的盖玻片进行样品安装，并在其整个区域内实现无遮挡的扫描范围。两个1.0-NA检测物镜能够在多种成像模式下进行高分辨率的毫米级视场研究（补充图1b-e和2-4）。所有三个物镜和样品都安置在一个环境腔室内，可完全控制温度、灌注和CO₂。第四个物镜同样是1.0-NA，位于MOSAIC内的正置工作站中，用于对较大样品（如活体小鼠）进行双光子成像（补充图1f）。 为了最大化大视场和快速光片成像所需的激发功率，MOSAIC使用了Powell/柱面透镜组合（补充图2a），将激光功率集中到空间光调制器上写入LLS图案的狭长区域。可以同时使用任意组合的七种可见激光，我们首先用一组平行二向色镜将它们经过Powell透镜后重叠的光片在SLM上分成七条独立的平行条纹（补充图5a）。这样便于为每种激光独立控制光片的倾斜、俯仰和AO校正的相位图案。经过SLM反射后，七种颜色通过相同的二向色镜组返回，重新组合成重叠共线的多色光束（补充图5a,b），该光束经过一个样品共轭的共振振镜（以减少样品引起的阴影伪影⁹）和两个瞳孔共轭振镜（用于LLS轴向对准和横向抖动），然后进入激发物镜（补充图2a）。由此，LLSM的体积视场（无拼接）从之前实现的100×~30×100μm³增加到MOSAIC中的200×~30×20,000μm³，并且由于聚焦激发和同时双色成像使用两台相机，成像速度提高了一倍以上（补充图2b和6b）。 AO-LLSM需要在硬件上投入大量资金（例如物镜、激光器、振镜、SLM、可变形镜、控制电子设备、样品台和相机）。MOSAIC通过根据需要将这些组件重新用于多种成像模式来最大化这一投资的价值，所有模式都具备AO校正：LLSM和LLS-SIM（补充图2a,b和6b）、斜透射光照明（补充图2c和6c）、宽场和3D-SIM（补充图2d和6d）、ISM（补充图3a和6e）、双光子贝塞尔光束光片（补充图3c和7a,b）、双光子点扫描显微镜（补充图4a和7d，包括倒置和正置配置）以及点扫描光刺激（补充图4b和7f）。光学切换器（补充图5c）在2-5秒内重新配置不同模式之间的光路，或在波前测量期间将成像相机重新配置为波前传感器。整个仪器（包括激光器）安装在一个1×1×1m³的容积内，有利于对准稳定性（补充视频1）。预中心化的反射镜和透镜无需调节（补充图5d），通过消除不必要的自由度简化了MOSAIC的组装和对准，进一步增强了稳定性。光学路径以及每种模式实验测量的点扩散函数和光学传递函数的表征见补充图2-4和8。 ### 超大视场下培养细胞生长的长期多模态成像 即使是培养细胞的克隆群体也表现出显著的结构和功能异质性¹²。更全面地理解这些细胞需要通过在单个实验中对多轮分裂中的大量细胞进行成像，来绘制其表型多样性。利用MOSAIC和LLSM的非侵入性，我们对稳定表达内质网和细胞核标记物的LLC-PK1细胞进行了体积成像，覆盖~1×0.75mm²的视场，以~260×260×431nm³的标称分辨率每90秒成像一次，持续~24小时（984个时间点；图1a,b和补充视频2）。整个49TB的数据集（包含约150万个细胞核图像体积（补充图9a））以最高4TB/h的速率采集，并由PetaKit5D¹³进行处理。 **图1：使用3D晶格光片或2D无标记斜照明显微镜进行大视场动态成像。** 图1：使用3D晶格光片或2D无标记斜照明显微镜进行大视场动态成像。此图像的替代文本可能由AI生成。 全尺寸图像 (https://www.nature.com/articles/s41592-026-03066-1/figures/1) **a**，来自补充视频2的LLSM图像，显示表达Calnexin-mEmerald（内质网）和H2B-mCherry（细胞核）的LLC-PK1细胞。最大强度投影显示1,000×750×10μm³体积的xy（上）和xz（下）视图。比例尺，50μm。**b**，来自图中a的细胞分裂事件的放大视图。品红色面板（左）：处于中期且具有大型内质网突起的细胞的体积渲染；蓝色面板（中）：从中期到末期的标称细胞分裂中的四个时间点；黄色面板（右）：罕见的三极有丝分裂事件中的六个时间点。比例尺，10μm。**c**，以1Hz进行的无标记OI成像（补充视频3）捕捉了HeLa细胞片状伪足的波动和污染细菌的复制。比例尺，10μm。右图：放大的视图（品红色框）显示三次细菌分裂事件（箭头）。比例尺，2μm。**d**，以1Hz在1,218×975μm²视场上对活U2OS细胞进行拼接无标记成像。比例尺，200μm。右图：单个处于分裂期的U2OS细胞在四个时间点的放大视图（白色框），显示凝聚的染色体（箭头）。比例尺，10μm（右图）。 细胞群体在初始成像后约12小时达到汇合后进入平台期（补充图9b和补充视频2），之后细胞斑块偶尔表现出类似组织的上皮细胞脱落行为（图1a）和重新附着。虽然绝大多数有丝分裂事件遵循典型模式（图1b），但我们也识别出非典型事件，例如一个具有大型顶端内质网突起的正在分裂的细胞（图1b），以及一个三极有丝分裂的例子。此前已有研究观察到这样的分裂¹³、¹⁴，但MOSAIC提供了该过程更详细的四维视图，其非侵入性使我们能够研究子细胞直至其最终凋亡（图1b）。从这个例子可以看出，MOSAIC覆盖的巨大时空范围（<10毫秒至24小时，260纳米至1毫米，即时间上10⁷和体积上10⁸）使得能够在大型细胞群体中定量测量结构和动力学的正常表型分布，以及识别和详细研究这些分布中可能重要的离群值。 为了提供与荧光蛋白特异性互补的全局细胞背景，MOSAIC整合了无标记斜照明。样品共轭SLM的均匀激光照明在激发物镜的后瞳孔处产生点状激发。将此点从瞳孔边缘依次向内引导，产生与倒置物镜收集锥成一定角度相交于样品的宽场照明（补充图1c和10a,b），该照明最初进入收集锥，然后与其相切，最后完全错过收集锥（分别产生明场、类DIC的斜照明或暗场图像）。