利用工程化电突触进行脑回路的长时程编辑

# 利用工程化电突触对脑回路进行长期编辑 来源：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868 ## 引言 电突触使离子和小分子能够在两个细胞之间直接流动，并在包括大脑在内的多个器官的电活动耦合中发挥重要作用[2](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR2)、[3](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR3)、[4](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR4)。电突触由多个间隙连接通道组成，每个通道由两个嵌入在相邻细胞膜中的对接半通道构成。每个半通道是一个寡聚体，由六个称为连接蛋白的单体蛋白组成，人类有21种连接蛋白亚型[5](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR5)、[6](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR6)。大多数连接蛋白可以形成单一亚型的半通道，这些半通道与自身对接形成同型间隙连接（图1a左侧）。 **图1：筛选仅具有异型对接能力的突变连接蛋白半通道对。** 图1：筛选仅具有异型对接能力的突变连接蛋白半通道对。此图片的替代文本可能由AI生成。 查看全尺寸图片 (https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y/figures/1) **a**，左侧示意图概述了引入异源WT连接蛋白半通道（粉色矩形）来调节由神经元（棕色和黄色）组成的特定神经回路的局限性。注意，连接蛋白半通道会在突触前神经元之间产生脱靶电突触（左侧）。右侧，使用仅具有异型对接能力的半通道（绿色和红色矩形）选择性调节特定神经回路的策略。 **b**，红色（iRFP670）和绿色（mEmerald）荧光交换图谱（左侧）以及具有对接兼容性（Cx36–Cx36；顶部）和不具备对接兼容性（Cx36–Cx45；底部）的半通道对的代表性流式细胞术图（右侧）。流式细胞术图中粉色虚线方框突出显示了表达两种不同荧光蛋白的细胞比例。 **c**，左侧，已知对接兼容性图谱的连接蛋白对的双重荧光标记细胞比例。右侧，Cx43(F199L)–Cx43(F199L)和Cx26(K168V N176H)–Cx43（参考文献[26](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR26)）的FETCH评分。右侧图中的蓝线表示对接不兼容连接蛋白对的已知阴性分布的平均值±标准误。 **d**，用于筛选仅异型对接半通道的*M. americana* Cx34.7和Cx35在EL1和EL2中的突变示意图。Cx34.7或Cx35特有或两者共有的位置和突变分别以绿色、红色和黑色显示。 **e**,**f**，Cx34.7（**e**）和Cx35（**f**）突变的同型FETCH结果图。这些突变的位置可通过突变编号和颜色映射回**d**中EL2的结构。圆形条形图显示同型突变组合与人类Cx36和Cx45异型配对（无法对接）相比的FETCH评分的Cohen's *D*效应量。中心的黑色水平线是效应量的比例尺。目标残基列在圆环边缘；替换的氨基酸列在内侧。间断的黑色圆圈分隔每个目标残基，浅紫色圆圈对应Cohen's *D*为零。破坏对接的突变也通过黑色箭头和字母突出显示。 **g**，Cx34.7和Cx35突变蛋白组合的异型FETCH结果。条形图显示异型突变组合相对于WT Cx34.7和Cx35配对的效应量。紫色圆圈提供了效应量为零的参考点。绿色间断圆圈对应于图中最外侧用绿色标签标识的Cx34.7突变。中心的黑色水平线是效应量的比例尺。关于*n*值和统计检验，请参见正文。关于箱线图的定义，请参见方法部分 (https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#Sec12)。 利用间隙连接进行神经回路编辑在*秀丽隐杆线虫*中已得到充分验证[7](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR7)、[8](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR8)、[9](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR9)、[10](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR10)。*秀丽隐杆线虫*不表达连接蛋白；因此，在两个相连的*秀丽隐杆线虫*神经元中异源表达脊椎动物连接蛋白36（Cx36）会导致形成不与其内源性间隙连接蛋白（innexins）相互作用的电突触。先前的工作已成功地在多种行为情境中应用这种编辑方法来修改回路生理学，包括*秀丽隐杆线虫*对多种化学和温度条件的迁移反应[8](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR8)、[9](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR9)、[10](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR10)、[11](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR11)。 利用间隙连接修复功能失调回路的前景也在*秀丽隐杆线虫*中得到了推进，如使用回路编辑来恢复诱导回路损伤动物的正常行为的实验所示[11](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR11)、[12](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR12)。然而，先前的工作突显了在更复杂生物体中使用间隙连接编辑特定回路的一个重大挑战。具体而言，当Cx36在两个相同细胞类型的感官神经元中表达并形成同型间隙连接时，原本正常的*秀丽隐杆线虫*在对嗅觉线索的反应中表现出行为紊乱[11](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR11)。由于脊椎动物大脑中相同细胞类型的细胞数量远多于*秀丽隐杆线虫*，连接蛋白在更多细胞之间形成同型间隙连接的能力可能会显著降低这种回路编辑方法在哺乳动物中的精确性（例如，脱靶调节；图1a左侧），进而导致更严重的行为紊乱。此外，在哺乳动物中异源表达来自其他物种的连接蛋白可能会导致由外源性和内源性连接蛋白共同组成的间隙连接，从而产生可能损害神经回路功能的非预期连接。 尽管几乎所有连接蛋白都能形成同型通道，但几种连接蛋白亚型可以与其他连接蛋白亚型对接形成异型通道[4](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR4)、[13](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR13)（图1a右侧）。我们推测，通过识别连接蛋白之间对接相互作用的机制[14](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR14)，我们可以设计一个偏向异型间隙连接形成的半通道对。我们还推测，我们可以通过工程化使这对半通道与哺乳动物CNS内源性连接蛋白不兼容对接。因此，该策略可以提供一种精确的方法来调节不同细胞类型之间的电流流动。 *M. americana*（白鲈鱼）表达哺乳动物神经元Cx36的两个同源物——连接蛋白34.7（Cx34.7）和连接蛋白35（Cx35）——它们形成一个异型间隙连接[1](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR1)。值得注意的是，当在非洲爪蟾卵母细胞中表达时，这种电突触表现出从Cx34.7到Cx35方向的通道级整流[1](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR1)。金鱼（*Carassius auratus*）CNS中Cx34.7和Cx35的直系同源物也形成一个异型间隙连接，并表现出相同方向的回路级整流[15](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR15)。总之，Cx34.7和Cx35可以形成具有内在方向性的异型间隙连接[15](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR15)，并且能够传导足以触发动作电位的电流[1](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR1)。此外，这些连接蛋白可能通过氨基酸序列突变来修改其生物物理特性。基于这些发现，本文利用Cx34.7和Cx35来工程化一种用于编辑哺乳动物回路的新型电突触。 ## 连接蛋白半通道对接的体外实验 为了建立一种评估连接蛋白对接特异性的方法，并最终工程化我们的电突触，我们利用了对接连接蛋白半通道的自然细胞周转。在哺乳动物细胞中，连接蛋白半通道可以通过协调的内吞和外排过程从膜上移除，导致完全对接的间隙连接被内化到称为连接蛋白小体的双层囊泡中[16](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR16)、[17](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR17)、[18](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR18)、[19](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR19)、[20](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR20)、[21](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR21)（图1b左上）。通过将连接蛋白单体与荧光蛋白标签融合，可以观察到标记的间隙连接从荧光细胞内化到非荧光细胞[21](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR21)、[22](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR22)（图1b上方）。 我们的方法使用了分别用mEmerald或iRFP670荧光融合蛋白瞬时转染单个连接蛋白的HEK293FT细胞群（图1b）。然后我们将表达连接蛋白对应物的HEK293FT细胞共铺板并孵育。最后，我们通过流式细胞术评估它们的荧光交换（扩展数据图1a–d）。由于半通道对接是将荧光标记的连接蛋白从其他细胞内化的先决条件，对接可以通过共铺板样品中双荧光标记的转染细胞比例来量化（图1b,c）。我们首先通过测试特性明确的连接蛋白亚型：Cx26、Cx36、Cx43和Cx45，验证了我们实验（称为HEK293FT细胞中连接蛋白小体的流式追踪，FETCH）的实用性。鉴于这些连接蛋白中的每一种都能进行同型对接[21](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR21)、[22](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR22)、[23](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y?error=cookies_not_supported&code=da8af4df-26e7-4f3b-be6a-7f3db5f3c868#ref-CR23)、[24](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR24)，我们在同型配对条件下测试了它们（双标记细胞比例FETCH平均值±标准误：Cx26–Cx26为24.8±1.8%，Cx36–Cx36为15.2±1.1%，Cx43–Cx43为19.5±0.4%，Cx45–Cx45为14.4±0.5%；图1c左侧）。我们还在先前有证据表明异型对接不兼容的配对组合中测试了它们（例如，Cx26–Cx43、Cx36–Cx43和Cx36–Cx45，其FETCH值分别为2.5±0.1%、0.8±0.1%和0.9±0.1%；图1c左侧）。值得注意的是，对接兼容对与对接不兼容对的群体中双标记细胞比例存在显著差异（*t*40=14.5，*P*=1.6×10⁻¹⁷，双尾非配对*t*检验）。这些结果确立了FETCH作为一种可用于广泛评估连接蛋白半通道对接兼容性的方法。 其次，我们通过测试两个影响间隙连接形成的连接蛋白突变来分析FETCH的实用性。具体来说，我们测试了一个先前显示会破坏向细胞膜运输的Cx43(F199L)突变体[25](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR25)。我们还评估了一个赋予与野生型（WT）Cx43异型对接兼容性的Cx26(K168V N176H)突变体（参考文献[26](https://www.nature.com/articles/s41586-026-10501-y#ref-CR26)）。在这两种情况下，我们测试了突变体的FETCH评分是否超过在未预期对接条件下细胞对的评分（该“已知阴性”分布的FETCH = 1.5±0.2%；*n*=92个新细胞对；图1c右侧蓝线，以及方法部分）。同型配对的Cx43(F199L)突变体未显示出高于已知阴性分布的荧光交换水平（FETCH = 2.1±0.3%，*t*96=0.85，*P*=0.20，单尾非配对*t*检验）。相比之下，与Cx43异型配对的Cx26(K168V N176H)突变体显示出显著增加的荧光交换（FETCH = 26.6±1.3%，*t*96=30.9，*P*=5.2×10⁻⁵²，非配对单尾*t*检验；图1c右侧）。因此，我们证实了我们的FETCH实验可用于识别破坏或实现对接兼容性的连接蛋白突变。 ## Cx34.7和Cx35突变半通道的对接 我们使用FETCH来检测一个Cx34.7和Cx35突变体库，评估它们对半通道对接的影响。虽然对于大多数连接蛋白，指导半通道对接的精确相互作用尚未完全阐明，但结构-功能分析和序列分析表明，两个细胞外环（EL1和EL2）在半通道