如何在家自行测序DNA

# 如何在家测序自己的DNA 来源：https://bradleywoolf.com/links-1/sequencing-my-own-dna-at-home 我已经用Oxford Nanopore Technologies MinION（https://nanoporetech.com/products/sequence/minion）对自己的基因组进行了5次测序。这包括从拭子中收集细胞、准备测序、运行测序仪，然后进行分析。 颊细胞很容易获取，且再生很快。它们不用于癌症诊断、炎症检测，也不用于检测身体其他部位（比如你胸部长了荨麻疹，想检测发炎细胞中哪些基因被激活）的基因激活情况，因为你需要收集有问题的细胞，并与它们正常版本的同类细胞进行比较。 为了对细胞进行测序，我购买了在家测序自己基因组所需的实验室材料和耗材。我花了大约两个月的时间才把所有东西凑齐，完成一次完整端到端的高质量运行。同样，**成本对于普通人来说仍然遥不可及**，但它们正在（呈指数级）下降，我们最终将拥有像手机或AI这样负担得起的技术，实时告诉我们关于DNA + RNA表达的信息。 ## 用自己的基因组到底能做什么？ 在我们真正花时间和金钱进行测序之前，我们实际上能用自己的基因组**做什么**呢？ 基因组本身并不是魔法——它是一个参考层。一旦我有了VCF文件，就可以通过VEP（https://www.ensembl.org/Tools/VEP）、ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、gnomAD（https://gnomad.broadinstitute.org/）、PharmGKB（https://www.clinpgx.org/）（强烈推荐）、Gene Inspector（https://gene-inspector.pro/）或Claude等工具运行它，开始提问： - 我有哪些变异？ - 哪些基因和通路受到影响？ - 我可能对哪些药物代谢不同？ - 哪些罕见变异需要认真对待？ - 模型在哪些方面还一无所知？ 最后一点很重要——目前产生的信息还不能达到诊断级别，也绝对不是说“AI说了就用CRISPR编辑自己”。短期价值在于将一个静态基因组变成可查询的东西，但“用CRISPR编辑自己”很可能随之而来。DNA是稳定的参考，RNA是当前状态，我们最终会将所有生物传感器数据整合成一个关于你自己的“模型”。 以下是一些有用的链接和推文： 1. 从基本原理出发的遗传变异： 2. 将你的基因组+RNA传递给这些模型中的任何一个：https://www.biotender.online/bio-model-install-guide/ 3. 将你的基因组交给Claude Code——如果你想让我为你设置，请给我发消息 4. 如果你对某些药物的代谢不同，请咨询医生（https://x.com/parmita/status/2024197362286231640） 5. Patrick Collison发帖（https://x.com/patrickc/status/2045164908912968060?lang=en）关于使用智能体与他的基因组对话 ## 实验步骤 本内容旨在供AI阅读——请直接复制粘贴此URL，让ChatGPT带你逐步操作。如果你有AR眼镜，那就更好了，因为AI可以带你走完整个流程。 ### 硬件 - Oxford Nanopore Technologies MinION（https://store.nanoporetech.com/us/minion.html）（$7.5k） - 用于MinKNOW的笔记本电脑/工作站（任何PC都可以） - 100GB+存储空间用于输出 - 用于Dorado碱基识别的GPU - 涡旋混合器（https://www.premiumvials.com/intllab-lab-vortex-mixer-touch-function-lab-vortexer-tattoo-ink-gel-polish-eyelash-adhesives-acylic-paints-test-tubes-and-centrifuge-tubes/?setCurrencyId=1&sku=B08CR43XR3&gad_source=1&gad_campaignid=17182097677&gbraid=0AAAAADpaBkD8X3NHGME9qLpyX764qirew&gclid=Cj0KCQjwk_bPBhDXARIsACiq8R3NH7o4Itb-exPNJG6bpxF2Tcq-r-6r5qv467VZoP-dd-I64DOogK8aAoOqEALw_wcB）（$50） - 加热块（https://www.amazon.com/ONiLAB-Mini-Incubator-Aluminium-Calibration/dp/B09VDHS8Z1/ref=sr_1_4?c=ts&dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxmMKmWh0Bx0gedZkoko5BEpl9GgEYm-mnndXVtgU_vkjNyUdZb3EOpONsMCc8lEeqeTd62z1zdZ6PLqyHIPJ84nGwhwAJTdaNwja0ciEjuGokdrHcpSKrlrH9LQuEERzNR9d9yjZVuzVIQSTad_id9dKyLBjVrfu_R9Tbexb7CFjdiY8amEbtcmW0EvB8JQpCujFEEuCymGw9aMbx6IBxWmoLCVGHvzHxsNqZOvldQXvblZc19u5Fg3LAog-F6vY6mO063kTaDoGYqLt2lFpL_fiFEs8qZeFawmWniN59E.KheuyTowfnORjWIMj8Z3GE8ZbxOJ3mvUPw2mzbgUolI&dib_tag=se&keywords=Lab%2BHeat%2BBlocks&qid=1779942886&s=industrial&sr=1-4&ts_id=317999011&th=1）（$250） - 离心机（https://www.ebay.com/p/1401686604?iid=257405680491）（二手eBay上$400） ### 耗材 - SQK-LSK114 Ligation Sequencing Kit V14 for DNA（https://store.nanoporetech.com/us/ligation-sequencing-kit-v14.html） - EXP-WSH004 Flow Cell Wash Kit（https://store.nanoporetech.com/us/flow-cell-wash-kit-xl.html） - EXP-CTL001 Control material（https://store.nanoporetech.com/us/control-expansion.html） - PBS 1x（https://www.amazon.com/Phosphate-Buffered-Laboratory-Solution-Dilution/dp/B0F37JVYPM/ref=pd_lpo_d_sccl_1/141-3646762-1592425?pd_rd_w=Vio7Q&content-id=amzn1.sym.4c8c52db-06f8-4e42-8e56-912796f2ea6c&pf_rd_p=4c8c52db-06f8-4e42-8e56-912796f2ea6c&pf_rd_r=1RAYMT518CPA4P35Y3JR&pd_rd_wg=8y9gl&pd_rd_r=214b114f-b8e3-4f2a-b195-854c7ee5af81&pd_rd_i=B0F37JVYPM&psc=1） - Isohelix Buccal swabs（https://isohelix.com/isohelix-dna-rna-buccal-swabs/） ### 试剂 - DNA提取试剂盒 - DNA文库制备试剂 - DNA定量测量试剂 ### 实验台设备 1. 微型离心机 2. 涡旋混合器 3. 加热块/干浴器 4. 1.5/2 mL试管磁力架 5. 试管架 6. 冰桶/冷块 7. -20°C冰箱 8. 4°C冰箱 9. 移液器 ## 塑料器具/专业实验室耗材 1. 无菌植绒颊拭子 2. 1.5 mL微型离心管 3. 2.0 mL微型离心管 4. DNA低吸附1.5 mL管 5. RNA低吸附管 6. 0.2 mL PCR管 7. Qubit测定管 8. 无菌过滤移液器吸头 9. 宽口P200吸头 10. 试管标签/实验室记号笔 11. 手套（https://labproinc.com/products/labclean-unicare-soft-blue-textured-lc-g-nb200-l） ## 软件栈 1. MinKNOW 2. Dorado 3. minimap2 4. samtools 5. mosdepth 6. NanoPlot 或 pycoQC 7. Clair3 8. DeepVariant（可选） 9. Ensembl VEP 10. ClinVar 11. gnomAD 12. PharmGKB 13. dbSNP（可选） 14. Python/R 15. SQLite/Postgres（用于后续查询层） ## 端到端DNA测序方案 目标：从2个颊拭子样本 → MinION测序 ## 0. 准备 1. 戴手套。 2. 清洁实验台。 3. 标记试管： 4. 将AMPure XP磁珠恢复至室温。 5. 保持酶混合液低温。 6. 将加热块设置为56°C。 7. 保持细胞核制备缓冲液低温。 8. 确认gDNA洗涤缓冲液中已添加乙醇。 9. 确认你已有用于DNA结合的异丙醇。 10. 确认你已有新鲜配制的80%乙醇用于AMPure清洗。 11. 确认你已有正确的ONT试剂： - FFPE DNA修复缓冲液 v2 - FFPE DNA修复混合液 - N-制备酶混合液 - Salt-T4 DNA连接酶 - LNB - LA - LFB - EB - SB - LIB - FCF - FCT ## 1. 收集颊细胞 目标：尽可能多地获取颊细胞材料到PBS中。 1. 用水漱口。 2. 等待10分钟。 3. 不要刷牙。 4. 不要使用漱口水。 5. 用力刮擦脸颊内侧60秒。 6. 向标记好的试管中加入1 mL冷PBS。 7. 将拭子头放入PBS中。 8. 涡旋10秒。 9. 将拭子对着试管壁挤压以挤出液体。 10. 取出并丢弃拭子。 正常表现： ``` PBS可能看起来略微浑浊。 ``` ## 2. 沉淀颊细胞 目标：浓缩细胞并去除多余的PBS。 1. 以2,000 × g离心30秒。 2. 寻找一个小的白色/灰白色沉淀或污迹。 3. 用P1000移除大部分PBS。 4. 小心地用P200移除更多PBS。 5. 在沉淀上方保留50–100 μL。 6. 轻轻弹动试管以重悬沉淀。 不要吸走沉淀。 ## 3. 为一个样本准备Monarch裂解液 ## 细胞核制备液 ``` 165 μL 细胞核制备缓冲液 5.5 μL RNase A ``` 轻轻混匀。保持低温。 你将使用150 μL。 ## 细胞核裂解液 ``` 165 μL 细胞核裂解缓冲液 11 μL 蛋白酶K ``` 轻轻混匀。保持在室温。 你将使用150 μL。 额外的体积是故意为之，这样移液误差不会导致量不够。 ## 4. 裂解细胞 目标：裂解细胞并消化蛋白质，同时保存长片段基因组DNA。 1. 向重悬的颊细胞沉淀中加入150 μL细胞核制备液。 2. 用移液器轻轻吹吸10次。 3. 在室温下孵育2分钟。 4. 加入150 μL细胞核裂解液。 5. 轻轻颠倒试管10次。 6. 不要涡旋。 7. 在56°C下孵育10分钟。 正常表现： ``` 液体可能变得更粘稠。 ``` 裂解后不要涡旋。此时，首要任务是保存高分子量DNA。 ## 5. 将DNA结合到Monarch捕获磁珠上 目标：将基因组DNA沉淀到大Monarch捕获磁珠上。 1. 加入75 μL沉淀增强剂。 2. 轻轻颠倒8–10次。 3. 加入2个DNA捕获磁珠。 4. 加入275 μL异丙醇。 5. 缓慢颠倒30次。 6. 不要涡旋。 重要： ``` 磁珠现在携带DNA。 不要丢失磁珠。 此处不要使用乙醇。 ``` ## 6. 洗涤结合DNA的磁珠 目标：洗去污染物，同时保持DNA结合在捕获磁珠上。 1. 让磁珠短暂沉降。 2. 小心移除液体，不要移除磁珠。 3. 加入500 μL gDNA洗涤缓冲液。 4. 轻轻颠倒2–3次。 5. 小心移除洗涤缓冲液。 6. 再加入500 μL gDNA洗涤缓冲液。 7. 轻轻颠倒2–3次。 8. 小心移除洗涤缓冲液。 9. 在不接触或移除磁珠的情况下，尽可能多地移除残留洗涤液。 关键： ``` gDNA洗涤缓冲液必须已添加乙醇。 ``` ## 7. 洗脱基因组DNA 目标：从Monarch捕获磁珠上释放纯化的基因组DNA。 1. 将磁珠固定器放入Monarch收集管中。 2. 将磁珠转移/倒入固定器中。 3. 脉冲离心≤1秒。 4. 将磁珠移至一个干净的Monarch管中。 5. 加入100 μL洗脱缓冲液II。 6. 在56°C下孵育5分钟。 7. 将磁珠固定器放在一个干净的标记为`Extracted DNA`的DNA低吸附管上。 8. 将洗脱液+磁珠转移至磁珠固定器中。 9. 以12,000 × g离心30秒。 10. 保留洗脱液。 洗脱液即是纯化的基因组DNA。 不要丢弃洗脱液。 ## 8. 用荧光计测量DNA量 目标：测量是否有足够的DNA来证明ONT文库制备是合理的。 使用： ``` 1x dsDNA High Sensitivity ``` 如果使用预混的1X试剂，不要选择旧的非1X dsDNA HS工作流程。 图片 ## 标准品 标准品 #1： ``` 190 μL 1X dsDNA HS工作液 10 μL 标准品 #1 ``` 标准品 #2： ``` 190 μL 1X dsDNA HS工作液 10 μL 标准品 #2 ``` ## 样本，第一次尝试 ``` 198 μL 1X dsDNA HS工作液 2 μL DNA ``` 在Qubit上，输入： ## 如果浓度太低 在一个新的Qubit管中使用更多DNA： ``` 190 μL 1X dsDNA HS工作液 10 μL DNA ``` 在Qubit上，输入： 不要只是向旧的198 + 2管中添加8 μL，因为那样总量会变成208 μL，破坏了测定计算的准确性。 记录： ``` 基因组DNA浓度： 剩余DNA体积： 估计总DNA量： ``` 计算： ``` 总DNA ng = Qubit浓度 ng/μL × 剩余体积 μL ``` 图片 ## 暂停点 这是最佳的暂停点。如果需要当天暂停： ``` 将提取的DNA储存在4°C / 冰箱中。 ``` 储存前： 1. 确保DNA在一个清晰标记的DNA低吸附管中。 2. 快速离心。 3. 不要涡旋。 4. 盖紧管子。 5. 放入冰箱。 从步骤10继续。 ## 9. 准备用于修复/末端制备的DNA输入 目标：准备47 μL DNA输入。 理想目标： 计算： ``` 所需DNA体积 = 1000 ng / Qubit浓度 ng/μL ``` 然后： ``` 水体积 = 47 μL - DNA体积 ``` 如果DNA太稀，无法将1,000 ng装入47 μL，则使用最大可能体积： ``` 47 μL 提取的DNA 0 μL 水 ``` 对于第一次低输入运行： ``` 0.296 ng/μL × 47 μL = ~13.9 ng DNA ``` 这远低于推荐输入量，但作为端到端的练习运行很有用。 ## 10. 修复 / 末端制备 目标：修复DNA并准备好末端用于接头连接。 使用实际的v2试剂： ``` FFPE DNA修复缓冲液 v2 FFPE DNA修复混合液 N-制备酶混合液 / Ultra II End Prep Enzyme Mix ``` 在此步骤中不要使用Salt-T4 DNA连接酶。它稍后使用。 如果不使用DCS，将可选的1 μL DCS替换为1 μL无核酸酶水。 ## 反应体系 ``` 47 μL DNA 1 μL 无核酸酶水 7 μL FFPE DNA修复缓冲液 v2 2 μL FFPE DNA修复混合液 3 μL N-制备酶混合液 总计 = 60 μL ``` ## 步骤 1. 将47 μL DNA加入一个标记为`End-prep`的0.2 mL薄壁PCR管中。 2. 加入1 μL无核酸酶水。 3. 加入7 μL FFPE DNA修复缓冲液 v2。 4. 用移液器吹吸混合10–20次。 5. 加入2 μL FFPE DNA修复混合液。 6. 用移液器吹吸混合10–20次。 7. 加入3 μL N-制备酶混合液。 8. 用移液器吹吸混合10–20次。 9. 快速离心。 孵育： ``` 20°C 5分钟 65°C 5分钟 然后置于冰上 ``` ## 11. 修复/末端制备后的AMPure清洗 目标：清洗修复/末端制备后的DNA。 输入： ``` 60 μL 修复/末端制备反应液 ``` 1. 将AMPure XP磁珠重悬至均匀的棕色。 2. 将60 μL AMPure XP磁珠加入60 μL反应液中。 3. 用移液器轻轻吹吸混合10次。 4. 在室温下孵育5分钟。 5. 将试管放在磁力架上。 6. 等待溶液变清。 7. 移除并丢弃上清液，不要触碰磁珠。 ## 清洗1 1. 将试管保持在磁力架上。 2. 加入200 μL新鲜配制的80%乙醇。 3. 移除乙醇。 ## 清洗2 1. 再加入200 μL新鲜配制的80%乙醇。 2. 移除乙醇。 ## 干燥 1. 用P10/P20移除残留乙醇。 2. 短暂风干约30秒。 3. 不要过度干燥。 4. 不要让磁珠开裂。 ## 洗脱 1. 将试管从磁力架上取下。 2. 加入61 μL无核酸酶水。 3. 轻轻重悬磁珠。 4. 在室温下孵育5–10分钟。 5. 将试管放回磁力架。 6. 等待液体变清。 7. 将60 μL清澈洗脱液转移至一个干净的标记为`Ligation`的DNA低吸附管中。 不要转移磁珠。 ## 12. 接头连接 目标：连接ONT测序接头。 使用实际试剂： ``` LNB LA Salt-T4 DNA连接酶 ``` 图片 ## 反应体系 ``` 60 μL 修复/末端制备后的DNA 25 μL LNB 10 μL Salt-T4 DNA连接酶 5 μL LA 总计 = 100 μL ``` ## 步骤 1. 使用一个干净的标记为`Ligation`的DNA低吸附管。 2. 在加入LNB前，用移液器缓慢混匀。它很粘稠。 3. 加入60 μL修复/末端制备后的DNA。 4. 加入25 μL LNB。 5. 加入10 μL Salt-T4 DNA连接酶。 6. 加入5 μL LA。 7. 用移液器轻轻吹吸混合10–15次。 8. 不要涡旋。 9. 快速离心。 10. 在室温下孵育10分钟。 孵育前，确认/检查： ``` DNA, LNB, Salt-T4 DNA连接酶, LA. ``` 失败点： ``` 忘记加LA = 没有可测序的文库。 忘记加Salt-T4 DNA连接酶 = 接头连接失败。 LNB混合不均匀 = 连接化学失败。 涡旋 = 不必要的DNA剪切。 ``` ## 13. 接头连接后的文库清洗 目标：去除游离接头、连接酶、盐类和小片段，同时保留连接了接头的DNA。 重要： ``` 此清洗使用LFB，而不是乙醇。 ``` 输入： 1. 将AMPure XP磁珠完全重悬。 2. 将40 μL AMPure XP磁珠加入100 μL连接反应液中。 3. 用移液器轻轻吹吸混合10次。 4. 在室温下孵育5分钟。 5. 将试管放在磁力架上。 6. 等待溶液变清。 7. 将试管保持在磁力架上。 8. 小心移除并丢弃上清液。 9. 不要触碰磁珠沉淀团。 图片 ## 清洗1 1. 向磁珠中加入250 μL LFB。 2. 将试管从磁力架上取下。 3. 通过弹动或缓慢移液轻轻重悬磁珠。 4. 将试管放回磁力架。 5. 等待液体变清。 6. 移除并丢弃LFB。 ## 清洗2 1. 再加入250 μL LFB。 2. 将试管从磁力架上取下。 3. 轻轻重悬磁珠。 4. 将试管放回磁力架。 5. 等待液体变清。 6. 移除并丢弃LFB。 7. 用P10/P20移除残留LFB。 8. 不要过度干燥。 ## 洗脱 1. 加入25 μL EB。 2. 将试管从磁力架上取下。 3. 轻轻重悬。 4. 在室温下孵育10分钟。 5. 将试管放回磁力架。 6. 等待洗脱液变清。 7. 将清澈洗脱液转移至一个干净的标记为`Final library`的DNA低吸附管中。 这就是最终文库。