基因工程改造的钩虫现在可以直接将人类治疗性抗体分泌到宿主的血液循环中，提供了一种潜在的、单次给药、持续数年的药物输送平台

# 转基因钩虫分泌抗河豚毒素人源单链抗体 来源：https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9?error=cookies_not_supported&code=1270f4db-8d1f-4c44-88bf-78d0133011e7 ## 引言 非肠道给药通过绕过胃肠道（GI）直接将药物和生物制剂递送入体内，以确保快速有效的吸收。传统方法（如静脉注射、皮下注射、肌肉注射和皮内注射）用于需要精确剂量或快速起效的治疗。然而，新的递送系统正在开发中，以提高生物制剂的效率、稳定性和靶向性，并且对生物体（例如基于寄生虫的基因和蛋白质向神经元的递送）的兴趣日益增长1 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR1)。类似地，钩虫可以被探索为一个创新的制药生物工厂平台，用于药物生产和直接递送到人类肠道2 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR2)。钩虫已经进化到能够在人类宿主体内存活多年，同时对宿主稳态的干扰最小3 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR3)，并且受控的人类钩虫感染在临床环境中是安全且耐受性良好的4 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9?error=cookies_not_supported&code=1270f4db-8d1f-4c44-88bf-78d0133011e7#ref-CR4),5 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9?error=cookies_not_supported&code=1270f4db-8d1f-4c44-88bf-78d0133011e7#ref-CR5),6 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR6)，这增强了它们作为制药生物工厂的潜力2 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR2)。这开辟了一条基于钩虫的体内组成型治疗递送替代途径，并且考虑到不同蠕虫占据不同的组织生态位，特定的蠕虫物种可以将转基因衍生产物递送到特定器官和组织。 寄生线虫功能基因组学工具的开发面临重大挑战。RNA干扰（RNAi）是基因敲低的主要工具之一，但其效果不一，且仅限于少数寄生线虫物种7 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR7),8 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR8)。成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas9）是一种革命性的基因组编辑技术，已适应于少数寄生线虫，主要是*Strongyloides stercoralis*和*S. ratti*（例如，参考文献9 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR9)）。在这些情况下，由于这些寄生线虫物种能够在哺乳动物宿主外完成整个生命周期，因此使用了为自由生活的*Caenorhabditis elegans*开发的显微注射方案9 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR9)。一份单一报告使用了*piggyBac*介导的转染系统进行基于CRISPR的插入，并在*Brugia malayi*的微丝蚴阶段产生了约3%的转染率，使得在完成生命周期后筛选转基因成虫变得困难10 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR10)。这种方法也可能导致多拷贝插入。由于寄生线虫生命周期的复杂性，加上其庞大、复杂且注释和特征化较差的基因组，基于CRISPR/Cas的程序化敲除（KO）和敲入（KI）转基因技术尚未在多个物种中实现。主要障碍包括缺乏已识别的基因组安全港（GSHs，基因组中可插入外源DNA而不破坏重要基因或调控元件的特定基因座11 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR11)），这可以促进靶向转基因插入，鉴于缺乏这些生物体中染色质可用性和可及性的数据，这一挑战尤为突出。此外，由于寄生线虫（与*C. elegans*相比）具有较厚的角质层，可保护线虫免受宿主免疫系统和环境胁迫，因此需要确定更有效的递送方法以促进转染，从而评估能够在多种线虫物种中可靠发挥作用的CRISPR/Cas9系统12 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR12)。制药生物工厂开发的其他障碍包括用于可遗传转基因的种系可及性有限，以及围绕寄生线虫分泌系统的知识空白。作为开发钩虫作为活的制药工厂（能够在宿主体内直接产生和递送治疗性蛋白质）的第一步，必须建立一个功能获得性转基因方案，以实现治疗性转基因在钩虫基因组中的稳定表达。 在这里，我们报告了方法学、技术性和概念性的进展，展示了成功生物工程化一种人类钩虫——*Ancylostoma ceylanicum*——以产生和分泌一种人源单链抗体s16-HuScFv，该抗体能够中和河豚毒素（TTX）13 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR13)。我们首先识别并优先选择了两个GSH，并使用下一代测序确认了钩虫基因组中CRISPR靶向位点处的成功染色体切割。接下来，我们在*A. ceylanicum*卵期基因组中一个GSH处进行了CRISPR程序化敲入*s16-HuScFv*转基因。为了确认成功的转基因、周围基因表达未受干扰以及通过生命周期的传递，我们展示了基因组测序、qRT-PCR和RNA-seq分析的结果。最后，我们证明了感染转基因钩虫的仓鼠血液中循环的s16-HuScFv介导的TTX中和作用。这一进展代表了朝着开发转基因人类钩虫制药生物工厂平台迈出的关键一步，该平台有潜力在患者体内持续、安全且有效地递送生物制剂2 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR2)。 ## 结果 ### 基因组安全港（GSH）区域的识别、优先排序和实验验证 最初，我们识别了GSH区域，并根据利用可用*A. ceylanicum*数据（见方法）的多组学驱动方法的结果，优先选择了两个（GSH1和GSH2）用于在钩虫基因组中插入s16-HuScFv转基因盒和其他相应构建元件（图1 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#Fig1)a,b (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#Fig1)）。使用STREME16 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR16) 鉴定了与*A. ceylanicum*生命周期中高表达基因相关的假定5'上游启动子序列（19个RNA-seq数据集14 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR14),15 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR15)）。该分析利用了一个数据库，其中包含*A. ceylanicum*基因组中编码的所有18,776个基因的功能注释、基于RNAseq的基因表达14 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR14),15 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR15) 以及质谱法衍生的排泄/分泌蛋白（ESP）蛋白质组学数据17 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR17)（补充数据1 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM3)；补充图1 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)）。鉴定出两个基因具有高表达、蛋白质分泌的证据以及与表达基因前1%（GSH1）或前2%（GSH2）相关的假定启动子序列，详情如下。使用这种方法是为了识别在生命周期中持续可及、与导致高基因表达的上游启动子序列相关、并且可能从分泌组织分泌并构成ESP的基因。 **图1：双链供体构建体和基因组安全港（GSH2）区域的图形表示。** 图1：双链供体构建体和基因组安全港（GSH2）区域的图形表示。此图像的替代文本可能由AI生成。 全尺寸图像 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9/figures/1) GSH2被识别在优先靶基因 *maker-ANCCEYDFT_Contig13-pred_gff_snap-gene-4.9* / *ACEY_002225* 的上游。**a** s16-HuScFv蛋白的结构域，如Chulanetra等人2012年所述13 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR13)。指示了s16-HuScFv的可变重链（VH）和可变轻链（VL）组分的各个免疫球蛋白框架区（FRs）和互补决定区（CDRs），由接头序列连接。**b** 双链供体构建体的遗传组分及其在“*ANCCEYDFT_contig13*”重叠群的GSH区域插入*A. ceylanicum*基因组。该构建体通过将人源单链抗体片段（s16-HuScFv）克隆到pCDNA3.1(+)骨架中（在NotI限制性位点），带有CMV启动子、多组氨酸（HIS）标签和牛生长激素多腺苷酸化终止序列（bGH/poly(A)）。供体构建体在其末端两侧各有约600 bp的同源臂（HA）。s16-HuScFv可变重链（VH）和可变轻链（VL）链区域以及接头序列的位置以绿色显示。左同源臂（LHA）位于两个重叠的单引导RNA（sgRNA）的位置，sgRNA 1（CHOPCHOP排名第5）和sgRNA 2（排名第13）。sgRNA序列的末端残基是CGG原型间隔子邻近基序。**c** *ACEY_002225* 在*A. ceylanicum*生命周期（包括幼虫L3、L4和成虫阶段）中的平均基因表达水平（对数尺度FPKM）。红色虚线表示所有基因在所有阶段的平均表达水平。**d** 基因组组装中*ANCCEYDFT_Contig13*重叠群上的GSH区域各基因的基因表达水平。X轴位置表示基因坐标，Y轴值表示基因表达水平。优先靶基因*ACEY_002225*以蓝色表示；红色虚线表示所有基因在所有阶段的平均表达水平。垂直延伸的紫色阴影区域表示目标“GSH2”区域。在基因组组装中，靶基因前有12,966 bp的序列。源数据以源数据文件形式提供。 对于第一个假定的GSH，我们在*A. ceylanicum*生命周期中所有表达基因前1%的5'上游区域中鉴定了一个富集序列基序（CACTCGTAA；*P*= 0.0016；STREME16 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR16) 二项式分布检验；补充数据2 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM3)），注释为*ceh-22*结合基序18 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR18) (*P*= 0.0026)。在具有该基序的基因中，我们优先选择了*ACEY_000382*，这是一种蛋白质二硫键异构酶，其表达水平高于所有*A. ceylanicum*基因的99.83%，含有用于分泌的信号肽19 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR19)，与*A. caninum*和*Necator americanus*钩虫中高度丰富的ESP直系同源20 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR20),21 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR21)，并且在雄性（25个肽）和雌性（21个肽）成虫*A. ceylanicum*的ESP中被检测到17 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR17)。一种蛋白质二硫键异构酶也是*Schistosoma mansoni*22 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR22) 和*S. japonicum*23 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR23) 分泌组以及根结线虫*Meloidogyne graminicola*24 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR24) 中最丰富的蛋白质之一，其中一种从食道腺分泌，可能在那里与宿主细胞外基质组分相互作用22 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR22)。*ACEY_000382* 两侧有几个在生命周期中高表达的其他基因，连续五个基因的表达水平滑动平均值在基因组中排名第二（补充图2a (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)）。用于gRNA设计的第一个优先基因组序列是*ACEY_000382*上游超过1,346 bp的基因间区域，以避免可能中断任何假定的启动子区域。我们将此区域称为“GSH1”。 第二个GSH采用相同的方法，使用所有表达基因的前2%，识别了一个与顶级富集16 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR16)的fkh-2基序18 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR18),25 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR25)（GGTAAACGTGTTTACGCCCGTGTTAACGATGGGTAAATTTGTGTGGTGTAAACACGT-TTACC；补充图1a (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)；见方法）相关的62 bp回文基序序列。在具有该上游基序的基因中，我们优先选择了*ACEY_002225*（免疫原性蛋白3），其表达水平高于所有*A. ceylanicum*基因的97.8%（图1c (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#Fig1)），含有用于分泌的信号肽，是*A. caninum*中ESP的直系同源，并且在雄性（6个肽）和雌性（8个肽）成虫*A. ceylanicum*的ESP中被检测到17 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#ref-CR17)（补充图1b (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)）。位于contig13上的*ACEY_002225* 周围有几个其他高表达基因（在contig上具有最高的滑动平均值；补充图2b (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)）。用于设计gRNA序列的第二个优先基因组序列是*ACEY_002225*上游超过1591 bp的基因间区域（图1d (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#Fig1)；补充图1c (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM1)）。我们避免了前1591 bp，旨在不中断任何假定的富集启动子序列（见补充数据3 (https://www.nature.com/articles/s41467-026-73447-9#MOESM3)）。我们将此区域称为“GSH2”。 两个GSH区域都被生命周期中高表达的基因包围，为靶向基因插入提供了优势。这些区域表现出高转录活性，降低了转基因沉默的风险，确保转基因保持活性并随时间持续表达其载体蛋白，并且周围的染色质处于开放和可及状态，有利于高效的转基因整合。对于*A. ceylanicum*中每个GSH的每组五个基因（两个上游、GSH靶基因、两个下游），人类钩虫*N. americanus*的直系同源物均为相互BLAST命中（即，从*A. ceylanicum*搜索到*N. americanus*，以及从*N. americanus*搜索到*A. ceylanicum*时，鉴定出相同的蛋白质对），并且它们在*N. americanus*基因组组装上也按顺序排列，具有相同的链方向rel